本文是学习GB-T 35098-2018 微束分析 透射电子显微术 植物病毒形态学的透射电子显微镜鉴定方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了使用透射电子显微镜对植物病毒进行形态学观察和鉴定的步骤、质量要求及鉴定报
告的发布。
本标准适用于各种类型透射电镜对植物病毒形态的观察和鉴定。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法
SN/T 2964 植物病毒检测规范
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
病 毒 virus
由核酸和蛋白质外壳组成且具有侵染活性并能够在细胞内自我复制的病原生物。
3.2
病 毒 粒 子 virion
成熟的或结构完整、有感染性的病毒个体。
3.3
衣壳 capsid
由集合的蛋白质亚单位组成并包围核酸基因组的对称蛋白质外壳。
3.4
核衣壳 nucleocapsid
由包围病毒核酸的蛋白质衣壳与核酸形成的组合体。
3.5
内含体 inclusion body
病毒侵染后在寄主细胞中产生的由病毒或者细胞组分共同构成的异常结构。
注:在光学显微镜或透射电镜下内含体显示不同的形态特征。
3.6
抗 原 antigen
能刺激动物机体产生抗体和致敏淋巴细胞并能与之发生特异性免疫结合反应的物质。
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3.7
抗体 antibody
动物机体受到抗原刺激而产生的、能与相应抗原发生特异性免疫结合反应的免疫球蛋白。
3.8
负染色 negative stain
采用高密度的重金属盐染色液提高试样颗粒背景电子密度的染色方法。
3.9
免疫电子显微术 immunoelectron microscopy
利用抗原与抗体特异性结合的原理在超微结构水平上定位、定性及半定量显示抗原的技术方法。
3.10
超薄切片 ultrathin section
采用超薄切片机切成的厚度为50 nm~100 nm 的生物试样薄片。
4.1
负染色技术原理:采用高密度的重金属盐染色液(如磷钨酸、醋酸铀等)包围低密度的试样颗粒,使
试样周围的电子密度得到增强,在透射电镜下显示暗背景衬托的浅色试样形态及微细结构,图像呈现负
反差。该方法直接对病毒悬液试样进行负染色,操作简便,分辨率高,可用于病毒快速诊断。
4.2
免疫电子显微术原理:免疫电子显微术分为免疫复合物电镜技术和免疫标记技术两大类。免疫复
合物电镜技术是对电镜载网上形成的抗原抗体免疫反应复合物进行负染色后直接电镜观察,其中免疫
吸附法具有富集病毒的作用,免疫修饰法具有血清学相关性识别的作用,适用于病毒快速诊断。免疫标
记技术是以抗体连接标记物(如胶体金)作为探针,对细胞表面或细胞内部的相应抗原进行定位、定性及
半定量测定。
4.3
超薄切片技术原理:将经过固定的生物试样包埋在树脂介质中,采用超薄切片机将固化的试样包
埋块切成厚度为50 nm~100nm 的薄片,供透射电镜观察用。
5.1.10 辉光放电仪。
5.1.11 移液器(20μL,200μL)。
5.2.1 磷酸二氢钠(分析纯)。
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5.2.10 磷钨酸(分析纯)。
5.2.11 钼酸铵(分析纯)。
5.2.12 亚甲基蓝。
5.2.13 病毒多克隆抗体。
5.2.14 PCR 检测离心管(0.5 mL,1.5 mL)。
5.2.15 封口膜。
5.2.16 包埋管。
5.2.17 硅胶包埋板。
5.2.18 覆 Formvar 膜的电镜载网。
超薄切片机、透射电镜应安装在独立的房间内,工作环境应符合以下要求:
a) 超薄切片机:相对湿度小于60%,温度(20±5)℃,电源电压(220±22)V,
电源频率(50± 1)Hz, 满足防震要求。
b) 透射电镜:相对湿度小于60%,温度(20±5)℃,电源电压(220±22)V,
电源频率(50± 1)Hz, 具备仪器专用地线,接地电阻值参照仪器说明书的要求。
6.1.1 分离提纯的植物病毒悬浮液。
6.1.2 人工接种病毒的鉴别寄主和繁殖寄主植物。
6.1.3 田间受植物病毒侵染的叶、茎、花、根等新鲜材料。
6.1.4 植物种子、球茎、苗木等繁殖材料。
6.2.1 田间作物和人工接种植物的取样及试样处理按照 SN/T 2964 的规定执行。
6.2.2 进出境植物检疫的取样按照 SN/T 2122 的规定执行。
6.3.1 组织粗汁液试样:将呈现明显感病症状或者隐症的植物组织以1 g 加 2 mL
的比例加入 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH
值7.0),在研钵中研磨,过滤或离心后获得粗汁液。小片组织可用微型研
磨器研磨,或者用手挤出组织汁液,或者压破叶表皮获得组织汁液。种子剥皮去仁后,将种皮于液氮中
研磨制备组织粗汁液,也可以在适当温度和光照条件下使其发芽后再制备获取组织粗汁液。磷酸缓冲
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液的配制参见附录 A。
6.3.2 提纯病毒试样:将分离提纯的病毒用双蒸馏水或0.01 mol/L
的磷酸缓冲液(pH 值7.0)稀释至 适合电镜观察的浓度。
6.3.3
超薄切片试样:采集呈现明显褪绿花叶症状的感病植物叶片,取病叶的退绿黄化边缘部位供超
薄切片前处理之用,不建议采用枯斑部位作为电镜试样。
6.4.1.1
负染色液的选择:根据植物病毒试样不同可采用2%(20 g/L) 磷钨酸(pH 值 6 .
7 ) 或 1 % (10 g/L)醋酸铀(pH
值4.2),实验中需要同时具备这两种负染色液。对于具有囊膜的病毒样品,还可
以选用2%(20 g/L) 钼酸铵(pH 值7.0)。负染色液的配制参见附录 A。
常用负染色液有:
a) 2%(20 g/L)磷钨酸水溶液(pH
值6.7):适用于大多数植物病毒,但对一些不稳定的病毒具有
破坏作用,需先用1%~2%戊二醛或多聚甲醛进行固定,然后再进行负染色。
b) 1%(10 g/L)醋酸铀水溶液(pH
值4.2):对植物病毒的破坏作用较小,图像分辨率更好,但容
易与样品中的盐类及其他成分反应产生沉淀物,不适宜对高盐的提纯试样和新鲜病组织汁液
负染色。
c) 2%(20 g/L)钼酸铵水溶液(pH
值7.0):性能稳定,反差较弱,对病毒破坏作用小,尤其适合于
具有囊膜的病毒负染色。
6.4.1.2 载网的预处理:采用辉光放电法对覆
Formvar 膜 的 电 镜 载 网 进 行 亲 水 化 处 理 , 使 支 持 膜 亲 水
化,便于病毒粒子的均匀附着。
6.4.1.3 负染色操作方法有悬滴法和漂浮法,如下:
a)
悬滴法:用镊子夹持载网,用移液器吸取一滴病毒试样悬液(或组织粗汁液)滴在亲水化处理过
的电镜载网上,然后用小滤纸片从载网边缘吸去多余液体,待液体将要完全干燥之前,滴上负
染色液,染色1 min~2min,
用滤纸吸去多余负染色液,自然晾干后供透射电镜观察。
b)
漂浮法:在培养皿内或载玻片上铺上封口膜,用移液器吸取一滴病毒试样悬液(或组织粗汁液)
滴在封口膜上,同时也将负染色液滴在封口膜上,将亲水化处理过的电镜载网倒扣在病毒悬液
滴上静置1 min~2min,
然后夹起载网,用小滤纸片从载网边缘部吸去多余液体,待液体将要
完全干燥之前,将载网倒扣在负染液滴上,静置1 min~2min,
夹起载网,用小滤纸片吸去多 余负染色液,自然晾干后供透射电镜观察。
6.4.2.1 免 疫 吸 附 法 :
a)
在培养皿内铺上封口膜,用移液器吸取一滴1:10~1:100倍稀释的病毒多克隆抗体并滴在
封口膜上;将电镜载网膜面朝下放置于抗体液滴上,室温下在培养皿中保湿15
min。
b) 用20滴0.05 mol/L 的磷酸缓冲液(pH
值7.0)连续滴洗载网,洗除多余抗体。
c)
用小滤纸片吸掉余液后,将载网膜面朝下放置于病毒试样悬液(或组织粗汁液)液滴上,室温下
在培养皿中保湿反应30 min
(如果病毒含量低,反应时间可延长至数小时或过夜)。
d) 反应结束后用20滴0.05 mol/L
的磷酸缓冲液、30滴双蒸馏水先后连续滴洗试样载网。
e) 用小滤纸片吸除余液后,以2%(20 g/L) 磷钨酸(pH 值6.7)进行负染色1 min
~2 min,用小 滤纸片吸去多余负染色液,自然晾干后供透射电镜观察。
6.4.2.2 免疫修饰法:
a)
在培养皿内铺上封口膜,用移液器吸取一滴1:10~1:100倍稀释的病毒抗体滴在封口膜上。
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b) 用电镜载网蘸取病毒试样悬液(或组织粗汁液),用数滴0.05 mol/L
的磷酸缓冲液(pH 值7.0)
滴洗载网,用小滤纸片吸掉余液后将电镜载网膜面朝下放置于抗体液滴上,盖上培养皿盖,室
温下保湿15 min~30 min。
c) 反应结束后用20滴0.05 mol/L
的磷酸缓冲液、30滴双蒸馏水先后连续滴洗试样载网。
d) 用小滤纸片吸除余液后,以2%(20 g/L) 磷钨酸(pH 值6.7)进行负染色1 min
~2 min,用 小 滤纸片吸去多余负染色液,自然晾干后供透射电镜观察。
6.4.2.3 免疫吸附-修饰法:
a) 先按照6.4.2.1的步骤 a)、b)、c)进行免疫吸附反应。
b) 反应结束后用20滴0.05 mol/L 的磷酸缓冲液连续滴洗试样载网。
c)
用小滤纸片吸除余液后将载网膜面朝下放置于抗体液滴上,在培养皿中保湿15
min~30 min。
d) 按照6.4.2.2的步骤
c)、d)进行滴洗和负染色,自然晾干后供透射电镜观察。
6.4.3.1 前固定:将感染病毒的植物组织切成1
mm×1mm×3mm 的小块,置于0.1 mol/L 磷酸缓冲 液(pH
值7.0~7.2)配制的2%~3%(体积分数)戊二醛固定液进行前固定,在4℃下固定2 h。
戊二醛 固定液的配制参见附录 A。
6.4.3.2 漂洗:用0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH
值7.0~7.2)充分漂洗3次,每次10 min~15 min。
6.4.3.3 后固定:经过漂洗后的试样置于0.1 mol/L
磷酸缓冲液(pH 值7.0~7.2)配制的1%(10 g/L) 四氧化锇固定液中,在4℃下固定1
h~2h; 再用相同缓冲液充分漂洗3次,每次10 min~15 min。 四
氧化锇固定液的配制参见附录 A。
6.4.3.4
脱水:采用50%、70%、80%、90%、95%、100%(体积分数)的乙醇进行梯度脱水,各级浓度乙
醇脱水时间为10 min~15 min。 然后用纯丙酮脱水2次,每次30 min。
6.4.3.5
浸透与包埋:试样在室温下脱水后放置于丙酮:包埋剂(1:1,体积分数)渗透液中浸透1
h, 然 后在丙酮:包埋剂(1:3,体积分数)渗透液中浸透3
h,之后在纯包埋剂中浸透12 h 以上。用包埋管、
胶囊或硅胶包埋板进行试样包埋。推荐采用Spurr '低黏度包埋剂、Epon 812
或其他包埋剂。 Spurr '低 黏度包埋剂和 Epon 812包埋剂的配制参见附录 A。
6.4.3.6
聚合:包埋后的试样在包埋聚合器或恒温烘箱内进行加温聚合。
6.4.3.7
修块:聚合后的包埋块修成易于超薄切片的形状。
6.4.3.8
定位:包埋块在超薄切片机上用玻璃刀进行半薄切片,切片厚度为0.5μm~1μm, 经
1 %
(10 g/L)亚甲基蓝染色后在正置光学显微镜下进行病变细胞定位。
6.4.3.9
超薄切片:经修块和定位后的包埋块在超薄切片机上用玻璃刀或钻石刀切成超薄切片,切片厚
度50 nm~100 nm,用电镜专用载网捞取超薄切片。
6.4.3.10 染色:采用2%(20 g/L醋酸铀乙醇溶液和柠檬酸铅在室温下对超薄切片进行双重染色,醋
酸铀染色时间15 min~30 min,柠檬酸铅染色时间5 min~10
min,干燥后待检。超薄切片染色液的配 制参见附录 A。
7.1
按照透射电镜操作程序开机,抽真空至正常工作状态,调整仪器至最佳工作状态。
7.2 推荐加速电压范围:60 kV~80 kV。
7.3 推荐放大倍率范围:4000倍~100000倍。
7.4
病毒负染色试样的透射电镜观察:先在低倍率(4000倍左右)下选择负染色剂着色的电子密度较
大斑点或斑块,观察样品全貌。逐步提高放大倍率,寻找具有典型形态特征的病毒粒子,图像精细聚焦
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后用CCD
相机记录并储存(或者用电子底片进行照相)。植物病毒各科、属的病毒形态学特征参见
附录 B 及相关文献。
7.5
感病试样超薄切片的透射电镜观察:先在低倍率模式(50倍~1000倍)寻找切片,切换到正常放
大模式观察病变的细胞。逐步提高放大倍率,仔细观察病毒粒子在细胞内的分布状况,是否产生特殊的
内含体,细胞超微结构以及各种细胞器是否异常。细胞图像精确聚焦后用CCD
相机记录并储存(或者
用电子底片进行照相)。植物病毒各科、属的细胞病理学特征参见附录 B
及相关文献。
8.1
负染色的电镜图片要求反差适中,病毒粒子分布均匀,形态清晰,表面细节可辨认。超薄切片的电
镜图片要求反差适中,层次分明,细胞超微结构清晰,细胞膜结构和病毒粒子清晰可辨。
8.2 植物病毒形态鉴定电镜图片应包括:
a) 磷钨酸和醋酸铀两种染色液负染色的病毒粒子形态;
b) 寄主细胞内病毒粒子的分布状态;
c) 内含体的形态结构;
d) 细胞和细胞器的超微结构变化;
e) 图片应具有标尺,用于测量病毒粒子的直径或/和长度。
9.1 鉴定报告应包括以下信息,亦可参照GB/T 27025—2008:
a) 报告的唯一编号;
b) 试样名称;
c) 送样人姓名、单位和地址;
d) 试样的接收日期;
e) 鉴定仪器及其工作条件;
f) 鉴定结果和必要的说明;
g) 鉴定人签字;
h) 鉴定报告负责人的签字;
i) 鉴定报告的页码;
j) 发布鉴定报告的实验室名称和地址;
k) 鉴定报告的日期。
9.2
原始记录应包括试样来源、试样接收日期、编号、电镜观察条件、图片或底片的编号、标尺或准确的
放大倍数。
对于列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》的植物病毒,在检测过程中使用的有关
材料和用具,当使用完毕后应进行消毒和除害处理。种子试样应保存在4℃冰箱内,叶片和果实试样应
保存在一20℃以下冰箱或冻干保存3个月备查,保存期满后进行灭活处理,以防病毒扩散。
style="width:0.58009in;height:0.5599in" />GB/T 35098—2018
(资料性附录)
常用试剂的配方
A.1 磷酸缓冲液配方
A.1.1 0.2 mol/L磷酸缓冲液贮存液
A 液 0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液:
NaH,PO ·H₂O
或 NaH₂PO₄ ·2H₂O
加双蒸馏水至1000 mL, 混匀。
B 液 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液:
Na₂HPO₄ ·2H₂O
或 Na₂HPO₄ · 12H₂O
加双蒸馏水至1000 mL, 混匀。
A.1.2 0.1 mol/L 磷酸缓冲液
35.61
71.64
按表 A.1 所列数量取 A 液 和 B 液混合,配制0.2 mol/L
磷酸缓冲液贮存液后,加1倍双蒸馏水即
为0.1 mol/L 磷酸缓冲液。按不同比例稀释可配制成不同浓度的磷酸缓冲液。
表 A.1 不同 pH 值磷酸缓冲液贮存液配制表
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A.2 固定液配方
A.2.1 戊二醛固定液
见表 A.2。
表 A.2 0.1 mol/L磷酸缓冲液配制的戊二醛固定液配制表
0.2 mol/L磷酸缓冲液/mL |
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A.2.2 四氧化锇固定液
先配置2%(20 g/L)四氧化锇贮存液,再配置1%(10 g/L)四氧化锇固定液,如下:
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a) 2%(20 g/L)四 氧 化 锇 贮 存 液
将装有四氧化锇的安瓿(共0 . 5 g)
清洗干净,用玻璃划割器在上面刻痕,再用双蒸馏水冲洗几次,放
入洁净棕色广口玻璃瓶内,加上25 mL
双蒸馏水,用洁净玻璃棒捣破安瓿。然后用石蜡将广口玻璃瓶
严密封口,贴上标签,置于干燥器中,4℃下避光保存。
b) 0.1 mol/L磷酸缓冲液配制的1%(10 g/L) 四 氧 化 锇 固 定 液
取等量的0 . 2 mol/L 磷 酸 缓 冲 液(pH 值7 . 2)与2%(20 g/L)
四氧化锇贮存液混合,现配现用。
A.3 包 埋 剂 配 方
A.3.1 环 氧 树 脂 Spurr '低黏度包埋剂
环 氧 树 脂 Spurr '低黏度包埋剂配制表见表 A.3。
表 A.3 环 氧 树 脂 Spurr
'低黏度包埋剂配制表
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10.0 g | 10.0 g | 10.0 g | 10.0 g | 10.0 g | 10.0 g |
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6.0 g | 5.0 g | 4.0 g | 7.0 g | 6.0 g | 6.0 g |
|
26.0 g | 26.0 g | 26.0 g | 26.0 g | 26.0 g | 26.0 g |
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0.4 mL | 0.4 mL | 0.4 mL | 0.4 mL | 1.0 mL | 0.2 mL |
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注1: 按上述比例将前3种成分混合均匀,再加DMAE
催化剂搅拌。配好的包埋剂在低温和防潮状态下可保存数
月。此包埋剂需用包埋管包埋,聚合时需加盖,以免包埋块发脆。在70℃温度下聚合8
h 即可完全聚合。此
包埋剂不易受潮。
注2: ERL-4206(Vinyl cyclohexene
dioxide),黏度低,聚合块硬度大。目前 ERL-4206 停产后由 ERL-4221
替代,它
的黏度稍大于 ERL-4206。 使 用ERL-4221 时,适当增加 DER-736
的比例可以得到硬度适中的包埋块。
DER-736(Diglycidyl ether of polypropylene
glycol),属于脂肪族,有低黏度性质,可调节包埋块的硬度。
NSA(Nonenyl succinic anhydride),硬化剂,避免暴露在潮湿的大气中。
DMAE(2-Dimethylaminoethanol),
催化剂,增加催化剂的比例,可以缩短聚合时间。
A.3.2 环 氧 树 脂 Epon812 包 埋 剂
环 氧 树 脂 Epon812 包埋剂配制表见表 A.4。
表 A.4 环 氧 树 脂 Epon812 包 埋
剂 配 制 表
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10 mL | 20 mL | 30 mL | 40 mL | 50 mL |
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10 g | 15 g |
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25 g |
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4.4 g | 5.5 g |
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3.9 g | 7.8 g | 11.7 g | 15.6 g | 19.5 g |
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0.15 mL | 0.30 mL | 0.45 mL | 0.60 mL | 0.75 mL |
注1: 按上述比例配好各成分,充分搅拌30 min,
驱除气泡。包埋样品分别在37℃、45℃、60℃下聚合12 h、12 h、
24h 或直接在60℃温度下聚合48 h。
此包埋剂易受潮,可以在干燥器中保存聚合后的样品包埋块。
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注2: Epon812 是环氧树脂单体。
DDSA(Dodecenylsuccinic anhydride)十二烷基琥珀酸酐,
一种可得到软性包埋块的长链脂肪族分子。
MNA(Methyl nadic
anhydride)甲基内次甲基二甲酸酐,又称六甲酸酐,有两个链环,能获得较硬的包埋块。
DMP-30[2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol]2,4,6-
三(二甲基氨基甲基)苯酚,能加速固化过程。
A.4 超薄切片染色液配方
A.4.1 醋酸铀染色液:称取1.0g 醋酸铀,用50 mL50%
(体积分数)的乙醇配制成2%(20 g/L) 醋酸铀
乙醇溶液,呈淡黄色,室温下避光保存。
A.4.2 柠檬酸铅染色液:称取硝酸铅1.33 g、柠檬酸三钠1.76 g, 放入50
mL 容量瓶中,加入预先煮沸
过的双蒸馏水30 mL, 混合后摇荡30 min, 混悬液呈乳白色,加1 mol/LNaOH 溶 液
8 mL 后混悬液逐
渐变澄清,pH 值为12,再加双蒸馏水定容至50 mL, 封闭瓶口。
A.5 负染色液配方
A.5.1 2%(20 g/L)磷钨酸负染色液
称取1.0 g 磷钨酸,用50 mL 双蒸馏水配制成2%(20 g/L) 的水溶液,用1 mol/L
NaOH 调 pH 值
至6.7~6.8,过滤后4℃下保存备用。
A.5.2 1%(10 g/L)醋酸铀负染色液
低盐的病毒提纯试样也可用1%(10 g/L)
醋酸铀水溶液进行负染色,具有更高的图像分辨率。称 取0.5 g 醋酸铀,用50 mL
双蒸馏水配制成醋酸铀负染色液,呈淡黄色,pH 值4.2,室温下避光保存
备用。
A.5.3 2%(20 g/L)钼酸铵负染色液
称取1.0 g 钼酸铵,用50 mL 双蒸馏水配制成2%(20 g/L)
的水溶液,用乙酸铵调 pH 值至7.0~
7.2,过滤后4℃下保存备用。
style="width:0.2134in;height:0.18675in" />
(资料性附录)
植物病毒各科、属的形态学和细胞病理学特征
根据国际病毒分类委员会2016年发布的病毒分类第十次报告,植物病毒涉及4个目、26个科、5个亚科、118个属,共有1323种。不同病毒具有
各自特定的粒子形态和细胞病理学特征,可以作为病毒检测鉴定的形态学依据(见表
B.1)。
表 B.1 植物病毒各科、属的形态学和细胞病理学特征
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22 nm×38 nm |
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20 nm |
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18 nm~20 nm |
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50 nm病毒样颗粒 100 nm具包膜粒子 |
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表 B.1 ( 续 )
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30 nm~40 nm |
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0 nm~85 nm |
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35 nm~40 nm |
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30 nm~120 nm |
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30 nm~100 nm |
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80 nm~120 nm 3 nm~10 nm×>100 nm |
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二
style="width:0.2068in;height:0.19336in" />
表 B.1 ( 续 )
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45 nm~100 nm×100 nm
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3 nm~4 nm×≥760 nm |
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25 nm~30 nm |
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12 nm~13 nm×470 nm~ 800 nm |
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12 nm~13 nm×600 nm~ 1000 nm |
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30 nm |
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表 B.1 ( 续 )
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30 nm~85 nm |
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900 nm,
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10 nm~13 nm×650 nm~ 2200 nm |
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25 nm~30 nm |
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28 nm~34 nm |
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20 nm×65 nm~390 nm |
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|
元
style="width:0.2134in;height:0.17338in" />
表 B.1 ( 续 )
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18 nm~25 nm×50 nm~ 310 nm |
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50 nm×150 nm |
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30 nm×50 nm |
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33 nm |
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18 nm×30 nm~62 nm |
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34 nm |
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25 nm~30 nm |
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GB/T 35098—2018
更多内容 可以 GB-T 35098-2018 微束分析 透射电子显微术 植物病毒形态学的透射电子显微镜鉴定方法. 进一步学习